今天是2020年10月27日 星期二,欢迎光临本站 上海电竞通有限公司 网址: www.fswqw.com

克隆感受态_电转

电竞通

文字:[大][中][小] 2016-8-9    浏览次数:2243    

BJ5183 Electroporation-Competent Cell 产品说明书



产品规格(CAT#: DE1075)

BJ5183 Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存条件(保质期):                                         -80℃(6个月)


基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)

 

产品说明

BJ5183是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株,是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBCrecBC双重突变,赋予BJ5183细胞较强的重组能力,有利于转入的目的基因与腺病毒质粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重组。endA1(缺失核酸内切酶)的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。StrR赋予BJ5183菌株链霉素抗性。BJ5183电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建,经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>1010cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙

醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中

静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的BJ5183电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)

并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;

B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

悬,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。

3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用

电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml

枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中

补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃,225 rpm复苏60分钟。

6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,

若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。


S.O.C培养基配方

 

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

  

注意事项

1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

6. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。

7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。





说明书下载

BJ5183 Electroporation-Competent Cell 产品说明书


返回上一步
打印此页
[向上]
在线客服

销售QQ

技术QQ

咨询电话:
021-34790199

请扫描二维码
打开手机站